Konfokalmikroskopie

16.07.2018

Mit der Konfokalen Laser-Scanning Mikroskopie (c-LSM) werden Oberflächentopografien auf einer mikroskopischen Größenskala optisch dreidimensional erfasst (Abb. 1). Die Höhenauflösung (z-Achse) der Methode liegt bei maximal 5 nm bis 10 nm mit einer Wiederholbarkeit (σ-1) von circa 1 nm. Die laterale (x,y) Auflösung der Methode liegt bei maximal 120 nm (1 Größenordnung besser als bei klassischen mikroskopischen Techniken). Die Bildfelder sind mit typischerweise 640 µm x 640 µm bzw. 256 µm x 256 μm relativ klein, können aber durch verbinden mehrerer Bilder vergrößert werden (Durchmesser des menschlichen Haar liegt bei ca. 70 µm.

Abb. 1: Beispielmessung einer Oberflächen mittels Konfokalmikroskopie

Der Aufbau eine c-LSM ist dem eines klassischen Mikroskops sehr ähnlich. Durch ein Linsensystem wird ein Objekt vergrößert und auf einem Detektor (Photomultiplier) abgebildet. Bei einem c-LSM wird kurz vor dem Detektor, durch eine bündelnde Linse, ein Zwischenfokus erzeugt, in welchem sich eine sehr kleine Blende (Durchmesser circa 50 μm) befindet. Als Resultat wird die Schärfentiefe des Gesamtsystems drastisch reduziert (Abb. 2). Damit ist die z-Position eines jede Bildpunktes genauer bekannt, als dies bei einem gewöhnliche Mikroskop der Fall wäre, und Höheninformationen im Bild lassen sich deutlich genauer ermitteln. Zur Steigerung des Effekts wird bei einem c-LSM ein blauer Laser als Lichtquelle verwendet, da dessen Licht feiner fokussiert werden kann, als bei polychromatischen Lichtquellen (Glühbirne).

Abb. 2: Schärfentiefe bei der Konfokalmikroskopie

Beim weitgehend zerstörungsfrei arbeitenden c-LSM kann die Probe in der Regel ohne Vorbehandlung unter dem Mikroskop positioniert und unter atmosphärischen Bedingungen vermessen werden. Kontaminationen oder Beschädigungen der Probe treten nicht auf. Große Winkel auf der Probe (Neigungen, Rundungen, Rampen) können ohne Probleme erfasst und ausgewertet werden (Abb. 3). Die Technik erlaubt die Aufnahme praktisch aller Materialien, unabhängig vom Glanz, der Transparenz, oder Farbe (auch reiner Kohlenstoff als Graphit, Diamant, Ruß). Die Methode liefert immer dann genaue und wiederholbare Ergebnisse, wenn ein Objektiv mit einer großen Numerischen Apertur (N.A.) verwendet wird. Diese geht allerdings immer mit einer hohen Vergrößerung und damit kleinem Bildfeld, sowie geringem Arbeitsabstand einher. Bei grob strukturierten, oder geneigten Proben kann es zu Problemen kommen. Nachteilig ist die begrenzte laterale Auflösung, die aber durch die universellen Einsatzfähigkeit ausgeglichen wird.

Abb. 3: Erfassung großer Winkel bei der Konfokalmikroskopie

Autor: Dr. rer. nat. Christoph Deusen, Olympus Deutschland GmbH